【团体标准】 花椒品种分子身份证构建方法

3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1标准样品经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，本标准中为农作物种子，即农作物的种植材料或者繁殖材料，包括籽粒、果实和根、茎、苗、芽、叶等。3.2分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。3.3SSR标记是一类由几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，由于基本单元重复次数的不同，形成了SSR长度的多态性。3.4DNA指纹具有完全个体特异的DNA多态性，本标准中指SSR等分子标记扩增的多态性。3.5品种身份证指反映品种的商品属性和DNA指纹信息的数字和（或）字母组合。4方法4.1DNA提取采用改良的CTAB法提取花椒新鲜叶片的DNA，具体包括以下步骤：(1)在65℃水浴中预热提前配置好的2×CTAB提取缓冲液，0.1MTris-HCl、0.02MEDTA、1.4MNaCl、2％PVP、2％CTAB；(2)在液氮中研磨石榴叶片至粉末状，转至2.0mL离心管中；(3)迅速加入2×CTAB提取缓冲液1.0mL，10μlβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴60min，隔10-15min颠倒摇匀一次；(4)常温下12000rpm离心5min，吸上清转移至新的2.0mL离心管中；(5)加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀5min，放置5min，12000rpm常温离心10min；(6)吸上清到新的2.0mL离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次；(7)离心，吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA；(8)10000rpm常温离心10min；(9)倒掉异丙醇，用500μL乙醇洗沉淀两次，吹干后用100μLTE溶解DNA；(10)加入10mg/mlRNaseA2μL终浓度200ng/ul混匀，37℃保温2h以上；(11)加入500μLTE，再加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒摇匀2min；(12)12000rpm常温离心10min；(13)吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA；(14)12000rpm常温离心10min；(15)倒掉异丙醇，用500μL乙醇清洗沉淀两次，吹干后用50μLTE溶解DNA；4℃冰箱中保存。(16)使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。4.2花椒叶片的转录组分析从花椒种质资源中选择20个花椒品种或品系，提取叶片总RNA，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行无参转录组测定，并在该公司在线分析平台美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com/)分析转录组数据。4.3分子标记引物的设计根据20个花椒叶片转录组数据分析结果，设计SSR引物和Indel引物。由于SRAP引物为通用引物，因此根据以往的文献报道，设计SRAP上下游引物。4.4SRAP标记扩增SRAP标记扩增体系是：样品基因组DNA1.0μL，2XTaq酶10.0μL，正反引物各1.0μL，ddH2O7.0μL；SRAP引物PCR扩增的程序:94℃预变性4min;94℃变性45s,35℃复性1min,72℃延伸2min,循环5次;再94℃变性45s,50℃退火1min,72℃延伸2min,循环35次;最后72℃延伸7min。4.5电泳检测96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，PCR产物1.0μl，其中该分子量内标和甲酰胺混合液两者的体积比为0.5：8.5；将PCR产物稀释40倍，在96孔板的各孔中分别加入8.5μl去离子甲酰胺、0.5μlLIZ-500分子量内标和1μl稀释后的PCR产物，95℃变性3min，于4℃放置10min，4000转min-1离心1min，于ABI3730DNA分析仪上进行毛细管电泳；预电泳15kV，3min；2kV电进样10s；电泳15kV，20min。4.6数据分析用DataCollection软件收集原始数据，用Genemapper软件分析收集的原始数据，比较各峰值的位置与其泳道中的LIZ-500分子量内标，获得SSR扩增片段的精确分子量bp；将花椒品种的DNA指纹信息编码，再结合品种的形态学特征特性及可能具有的特异基因信息，构建花椒资源品种的分子身份证，并利用在线条码生成器http://barcode.tecit.combarcodege.nerator.aspx？LANG＝zhcn和二维码生成软件Encoder2以条码表述构建的花椒品种身份证。